Robert De Niro Jr., 17 Ağustos 1943 de New York'da sanatkar bir ailenin çocuğu olarak dünyaya geldi. Annesi Virginia Admiral bir ressam, babası Robert ise hem bir ressam hem de şairdi. De Niro'nun çocukluğu özgür ve yalnız geçti. New York'daki İtalyan mahallesinde, sıskalığından dolayı "Bobby Milk" diye bilinirdi. Utangaç bir çocuk olan De Niro, romanları her zaman arkadaşlara tercih etti. Bu ürkekliğini 10 yaşında rol aldığı Wizard of Oz oyununda, aslan karakterini oynayarak yendi.

Çocukluğunun büyük bölümünü sokaklarda küçük çetelerle geçirdi. Oyunculuk ağır bastığında ilk rolü 16 yaşında oynadığı Chekhov'un The Bear filmi oldu. O zamandan itibaren 15 yıl boyunca lokantalarda ve ufak sahnelerde oyunlar oynadı.

Zamanının birçok ünlü aktörü gibi, metodlu aktörlüğün savunucuları Stella Adler ve Lee Strasberg'le çalıştı. De Niro'nun ilk rolü The Wedding Party adlı filmdeydi. Film, Brian De Palma tarafından çekilmesi nedeniyle oldukça önemlidir. 1963'te çekilen film 1969'a kadar gösterime girmedi. Sonraki iki filmi yine De Palma'nın Greetings ve Hi, Mom! adlı filmleriydi. 1973 yılına gelindiğinde artık De Niro tamamen Hollywood'a girmeye karar verdi.

Ölümcül bir hastalığı olan beyzbol oyuncusunu canlandırdığı Bang the Drum Slowly ona, New York Film eleştirmenleri "En iyi oyuncu" ödülünü kazandırdı. Aynı yıl De Niro, Martin Scorsese'nin Mean Streets filminde rol aldı. İlerleyen yıllarda bu ikili Taxi Driver (Taksi Şöförü), Raging Bull (Kızgın Boğa) ve GoodFellas (Sıkı Dostlar) da dahil olmak üzere toplam 6 defa bir araya geleceklerdi.

1974'de Francis Ford Coppola'nın The Godfather 2 filmi De Niro'yu bir süperstar statüsüne ulaştırdı. Bu filmdeki genç Vito Corleone rolüyle yardımcı aktör dalında oskar ödülünün sahibi oldu ve ona yeni Marlon Brando gibi yakıştırılmalar yapılmasını sağladı. Raging Bull (Kızgın Boğa) da Jake La Motta karakteri için 30 kilo alarak rolü için herşeyi yapacağını gösterdi. Bu rolüyle de en iyi erkek oyuncu dalında Oskar ödülünün sahibi oldu.

1976'da Diahnne Abbott adlı aktrisle evlendi ve Raphael adında bir çocuğu oldu. Evliliğinden bir kaç yıl sonra ayrıldı. De Niro'nun eski kız arkadaşı Toukie Smith'den ikiz ve eski karısı Diahnne Abbot'dan bir kızı ve oğlu var.